1 maja zawiercie

Wabik nie wpływał na zdolność C2C12. S do ulegania różnicowaniu w odpowiedzi na wycofanie czynnika wzrostu (Figura 1F), ale częściowo uratowała hamowanie Foxo1-ADA różnicowania mioblastów (Figura 1G). Jako alternatywna sonda do blokowania przekazywania sygnału Notch, związek E (34) inhibitora prezeniliny (PSI) również uratował hamowanie Foxo1-ADA różnicowania mioblastów (Figura 1H). Aby zbadać wpływ Foxo1 na sygnalizację Notch, przeprowadzono kotransfekcję siRNA Foxo1 i Notch1-IC. Foxo1 siRNA uratowało hamowanie różnicowania mioblastów i ekspresję miozyny przez Notch1-IC (Figura 1I), podczas gdy siRNA kontrolna nie wywierała skutku (dane nie pokazane). Aby wykluczyć niespecyficzne działanie siRNA Foxo1 na różnicowanie mioblastów, wygenerowaliśmy oporny na siRNA Foxo1-ADA (Suplement 5). SiRNA Foxo1 odwracał działanie Foxo1-ADA (Figura 1J), ale nie zdołał uratować hamowania różnicowania C2C12 powodowanego przez oporny na siRNA Foxo1-ADA (Figura 1K). Prezentujemy analizę ilościową tych danych na rysunku 2A, pokazując, że Foxo1 i Notch1-IC obniżały poziom miozyny o ponad 80%, podczas gdy wabik Notch i siRNA Foxo1 przywracały je do około 70% w pełni zróżnicowanych komórek. Uzyskaliśmy podobne dane, wykonując analizę morfometryczną komórek pozytywnych dla miozyny (Figura 2B). Dane te wskazują, że Foxo1 jest wymagany do wpływu Notch na różnicowanie mioblastów. Figura 2 Jakościowa analiza różnicowania C2C12. (A) Analiza Western blotting miozyny w komórkach C2C12. (B) Analiza morfometryczna komórek pozytywnych względem miozyny. Wyniki z eksperymentów różnicowania analizowano, oceniając liczbę komórek z wybarwionym miozyną jako procent wszystkich komórek DAPI-dodatnich. (C) Testy genu reporterowego DBD-Foxo1-ADA. Przeprowadziliśmy testy genu reporterowego z użyciem kanonicznego promotora IgFbp1 reagującego na Foxo1 (lewy panel) i promotora Hes1 (prawy panel) w komórkach kotransfekowanych Foxo1-ADA lub DBD-Foxo1-ADA. Western blot (wkładka) pokazuje, że poziomy ekspresji 2 białek są podobne. Gwiazdka wskazuje P <0,01 na ANOVA. Następnie ustaliliśmy, czy Foxo1 wpływa na różnicowanie poprzez swoją funkcję transkrypcyjną. W tym celu wygenerowaliśmy mutanta z niedoborem wiązania DNA (DBD) w szkielecie mutanta ADA, zastępując N208A i H212R (DBD-Foxo1-ADA) (6, 35). Potwierdziliśmy, że ten mutant nie jest zdolny do wiązania DNA przez pomiar aktywności białka (Igfbp1) wiążącej insulinopodobnego czynnika wzrostu, kanonicznego celu Foxo1. Foxo1-ADA zwiększył aktywność promotora Igfbp1 o 10-krotnie, podczas gdy DBD-Foxo1-ADA nie był w stanie tego zrobić (Figura 2C). Niespodziewanie, ten mutant był tak samo skuteczny jak kompetentny Foxo1-ADA wiążący DNA w hamowaniu różnicowania (Figura 1L). Dane te wskazują, że Foxo1 kontroluje różnicowanie niezależnie od jego zdolności do wiązania DNA w sposób specyficzny dla sekwencji. Foxo1 wiąże się z CsI i jest rekrutowany do promotora Hes1. Notch1-IC wiąże się i koaktywuje CsI, aby promować ekspresję Hes i Hey (11). Opierając się na wynikach z mutantem DBD-Foxo1-ADA, ustaliliśmy, czy Foxo1 oddziałuje z CsI w sposób zależny od Notch, stosując współhodowlę komórek C2C12 wyrażających receptor Notch1 z komórkami HEK293 eksprymującymi ligand Notch Jagged1 lub LacZ jako kontrolę ujemną. Dostarczamy kilka linii dowodów na to, że Foxo1 i Csl oddziałują w hodowanych komórkach. Wykryliśmy endogenny Foxo1 w endogennych immunoprecypitatach CsI, a koimmunoprecypitacja została znacząco wzmocniona przez aktywację sygnalizacji Notch (Figura 3A). Aby potwierdzić specyficzność interakcji, eksprymowaliśmy znakowany HA znakowany Foxo1 i znakowany FLAG Csl w komórkach C2C12. Po immunoprecypitacji z surowicą odpornościową anty-HA (Foxo1), wykryliśmy FLAG-CsI w immunoblotach (Figura 3B) [przypisy: dermatolog leszno, apteka silesia wałbrzych, przychodnia mościckiego tarnów ]