dębska laryngolog warszawa

I odwrotnie, po immunoprecypitacji surowicy odpornościowej anty-FLAG (CsI), wykryliśmy HA-Foxo1 w immunoblotach (Figura 3C). Zdolność do koimmunoprecypitacji z CsI wydaje się być specyficzna dla Foxo1, ponieważ nie udało się wykryć innych izoform Foxo w immunoprecypitatach CsI (Supplemental Figure 6). Skrócony mutant Foxo1 (<256, kodujący a x 256) (36) zachowywał zdolność oddziaływania z CsI. Wykryliśmy FLAG-CsI w immunoprecypitatach (Figura 3D) i HA-y 256 w immunoprecypitatach FLAG-Csl (Figura 3E), wskazując, że CsI oddziałuje z domeną końcową Foxo1N. Fig. 3Foxo1 koimmunoprecypituje z CsI. (A) Koimmunoprecypitacja endogennego Foxo1 i Csl w komórkach C2C12 hodowanych z ekspresją LacZ (oznaczonymi znakiem minus) lub komórkami HEK293 wyrażającymi Jagged1 (oznaczonymi znakiem plus). (B i C) Eksperymenty koimmunoprecypitacji w komórkach C2C12 kotransfekowanych FLAG-Csl i HA-Foxo1. (D i E) Eksperymenty koimmunoprecypitacji w komórkach C2C12 kotransfekowanych FLAG-CsI i skróconym mutantem Myc lub HA znakowanym. 256 Foxo1. TCL, całkowity lizat komórkowy. Aby ustalić, czy jest to bezpośrednie oddziaływanie białko-białko i mapować domenę interakcyjną (interakcje), najpierw przeprowadziliśmy testy rozszczepienia z oczyszczoną przez powinowactwo S-transferazą glutationową: – Foxo1 (GST-Foxo1) wytwarzany w bakteriach i FLAG- Csl ulega ekspresji w komórkach HEK293. Wykryliśmy związek CsI z pełnej długości i N końcowym Foxo1 (aa 300), ale nie z C-końcowym Foxo1 (aa 290. 655) lub GST (Figura 4A). Następnie zmapowaliśmy domenę Csl, która wchodzi w interakcję z Foxo1 przy użyciu systemu bezkomórkowego z GST-Foxo1 i GST-Flag-Csl oczyszczonymi z hodowli bakteryjnych. Ponownie odzyskaliśmy pełnej długości (aa <655) i N-końcowej (aa ~ 300), ale nie C-końcowej (aa 290. 655) Foxo1 w immunoprecypitatach CsI. Odwrotnie, N-terminalny Foxo1 oddziałuje z N-końcowym CsI (fig. 4B). Figura 4Foxo1 wiąże się bezpośrednio z CsI. (A) Testy rozciągania GST białka fuzyjnego GST-Foxo1 z immunoprecypitacją CsI z komórek HEK293. (B i C) Wiązanie GST-Foxo1 i GST-FLAG-Cs1 w systemie bezkomórkowym i mapowanie domeny interakcji CsI. Pełnej długości i skrócone fragmenty GST-Foxo1 i GST-FLAG-Cs1 oczyszczano z bakterii i koinkubowano. Następnie izolowano Csl przy użyciu przeciwciała anty-FLAG, a immunoprecypitat analizowano przez immunoblotting z przeciwciałami anty-Foxo1 lub anty-FLAG. (D) Test ChIP dla promotora Hes1 obejmujący miejsce wiązania CsI w komórkach C2C12 w celu wykrycia endogennego Foxo1, Csl i Notch1 (Endog) lub po transdukcji Foxo1-ADA podczas różnicowania mioblastów. Wejście reprezentuje DNA wyekstrahowany z chromatyny przed immunoprecypitacją. Pokazano ekspresję Hes1 (półilościowa RT-PCR) i miozyny (Western blot) odpowiadającą każdemu punktowi czasowemu. Dzień 0 definiuje się jako czas, w którym komórki pozbawiono surowicy w celu zaindukowania fuzji mioblastów. Użyliśmy mutantów delecji Csl do zmapowania domeny wiążącej Foxo1 w Csl. Te badania wskazują, że Foxo1 wiąże się z domeną obejmującą aa 172. 279 (Figura 4C), która jest zawarta w domenie CsI NH2 domeny terminalnej (NTD) (37) (Figura 4C). Co ciekawe, ta domena jest wymagana do wiązania DNA i korelatora, ale nie przyczynia się do wiązania Notch (38, 39). CsL wiąże się z sekwencją konsensusową w promotorze Hes1 (40), co zapewnia użyteczny test odczytu oddziaływania Foxo / CsI. Jeśli te ostatnie były wymagane do regulacji różnicowania C2C12, należy spełnić 3 przewidywane warunki: (a) Foxo1 powinno być wykrywane w testach immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) obejmujących element Csl w promotorze Hes1; (b) interakcja powinna być zależna od różnicowania; i (c) hamowaniu różnicowania przez Foxo1-ADA powinno towarzyszyć konstytutywne wiązanie z elementem Csl w promotorze Hes1 [patrz też: przychodnia mościckiego tarnów, dermatolog leszno, eurotrops ]