ile kosztuje wymiana stawu kolanowego

Wyniki są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach. (C) Koniec C WNK3 (WNK3 421. 1,743) zwiększył aktywność NCC w sposób podobny do WNK3 pełnej długości. Stymulacja NCC była hamowana przez hydrochlorotiazyd (HCTZ). Ani sam WNK3, ani sam WNK3 421. 1,743 nie stymulowały wychwytywania Na przy braku NCC. WNK3 2. 420 nie miało wpływu na aktywność NCC (dane nie pokazane); n = 5. (D) Wszystkie konstrukty WNK3 ulegały ekspresji na poziomie białka (Western blot lizatu oocytu Xenopus). (E) WNK3 421. 1,743, ale nie domena kinazy WNK3 2. 420, zwiększyła obfitość NCC w błonie komórkowej oocytów, co wykryto za pomocą immunocytochemii (wyniki są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach). Oryginalne powiększenie, × 400. Analiza Western blot lizatu oocytu nie wykazała wpływu na całkowite NCC. (F) Porównanie struktury domenowej WNK1 i konstruktów zastosowanych w niniejszych doświadczeniach. AID, domena autoinhibitory; CCD, domena zwojowa. Porównywano sekwencje autoinhibitorowych domen kinaz WNK. Kluczowe fenyloalaniny, które okazały się istotne dla autoagresji WNK1 (24), są podświetlone na niebiesko. WNK1 zawiera domenę auto-hamującą, tylko C-końcową do swojej domeny kinazy (24), która hamuje jej aktywność. Tak więc konstrukt WNK1-1. 555 jest względnie kinazową nieaktywną, w przeciwieństwie do krótszego konstruktu WNK1 1. 491 (21, 24). Dłuższy konstrukt, WNK1 639, zawierający dodatkowe reszty aminokwasowe, w tym domenę zwojową, wykazuje jednak aktywność kinazy. Wskazuje to, że region WNK1 między 555 a 639 reprymuje domenę autoinhibitorową (24). Aby sprawdzić, czy WNK3 zawiera podobną strukturę domenową, eksprymowaliśmy dłuższą konstruktową transferazę glutationu S – WNK3 (GST-WNK3) 2. 586, który zawiera domniemaną domenę autoinhibitorową oraz sąsiednią i zwiniętą domenę zwojową (patrz schemat, Figura 1F ). Konstrukt ten nie wykazywał żadnej wykrywalnej aktywności kinazy (Figura 1B), co wskazuje, że domena zwojów zwojowych WNK3 nie hamuje domeny autohazy. WNK3 2. 420 fosforyluje również martwą w kinazę WNK1 (WNK1 1. 491 D368A) i nieaktywną kinazę WNK3 2. 586, co wskazuje, że WNK3 jest zdolny do fosforylacji innych członków rodziny WNK i WNK3 z krzyżową fosforylacją (Figura 1B). . Ponieważ działanie WNK3 na NCC wydawało się zależne funkcjonalnie od aktywności kinazy WNK3 (Figura 1A i odniesienie 20), wykorzystaliśmy strategię delecji, aby sprawdzić, czy domena kinazy WNK3 może stymulować NCC. Niespodziewanie domena kinazy WNK3 (WNK3 2. 420), konstrukt wykazujący pełną aktywność kinazy in vitro (Figura 1B), nie miała wpływu na aktywność NCC (pobór: 102%. 15% samego NCC, P = NS). W przeciwieństwie do tego, koniec karboksylowy, WNK3 421. 1,743, konstrukt pozbawiony aktywności kinazy, miał taki sam efekt stymulujący na NCC jak WNK3 pełnej długości (Figura 1C). Zdolność WNK3 do stymulacji NCC była w pełni hamowana przez hydrochlorotiazyd (HCTZ), co wskazuje, że wynika ona ze zwiększonej aktywności NCC. Ponadto ani WNK3, ani konstrukty WNK3 z aminowymi lub karboksylowymi końcami nie stymulowały wychwytywania Na przy nieobecności NCC, dodatkowo potwierdzając, że obserwowana stymulacja zależy całkowicie od aktywacji NCC. Wszystkie konstrukty WNK3 ulegały ekspresji na poziomie białka, wskazując, że zróżnicowana ekspresja białka WNK3 nie wyjaśnia tych wyników (Figura 1D). Potwierdziliśmy, że wpływ na aktywność NCC był związany z równoległymi zmianami w powierzchni obfitości powierzchni NCC (20), co udokumentowano immunofluorescencją utrwalonych komórek jajowych (rysunek 1E). Nie było wykrywalnego wpływu WNK3 na całkowitą obfitość (rysunek 1E). WNK3 i fosforylowana WNK1 WNK4
[podobne: dermatolog leszno, melita medical wrocław, apteka silesia ]