odciągacz kataru odkurzacz

Biorąc pod uwagę dowody, że wpływ WNK3 na NCC można oddzielić od aktywności WNK3 jako kinazy, byliśmy zainteresowani poszukiwaniem molekularnych podstaw interakcji kinaz WNK. Wcześniej pokazaliśmy, że WNK1 i WNK4 wchodzą w interakcje w celu regulacji aktywności NCC (15, 21, 22), a Cobb i współpracownicy wykazali, że WNK1 może fosforylować WNK4 w obrębie domeny kinazy (25). Tutaj badaliśmy, czy WNK1 może fosforylować WNK4 poza domeną kinazy. Figura 2, A i B pokazują, że WNK1 jest zdolny do fosforylowania zarówno domen karboksy- (WNK4 1,172. 1,222), jak i na końcu aminowym (WNK4.1. 167). Co ciekawe, WNK1 nie był zdolny do fosforylowania claudyny 4 (Figura 2A). Następnie sprawdziliśmy, czy WNK3 wykazuje podobną aktywność. Figura 2C pokazuje, że WNK3 2. 420 fosforyluje oba końce aminowe i karboksylowe WNK4 in vitro. Zatem zarówno WNK1, jak i WNK3 są zdolne do fosforylowania WNK4 in vitro. Figura 2 Kinaza WNK i aktywność hamująca. (A) WNK1.1. 491 fosforyluje koniec karboksylowy WNK4, ale nie zawiera klauniny 4. (B) WNK1 1. 491 fosforylowanego i domeny końca aminowego WNK4 (WNK4.1. 167). (C) WNK3 2. 420, ale nie WNK3 2. 420 D294A, fosforylowało oba końce aminowe i karboksylowe WNK4. Wyniki są reprezentatywne dla 5 identycznych eksperymentów. (D) KS-WNK1 2a 84 hamował aktywność kinazy WNK3 w sposób zależny od dawki, podczas gdy sam GST nie wykazywał żadnego działania. Wyniki są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach. (E) GST-WNK4 445A 518 hamował fosforylację WNK3 siebie i histonu w sposób zależny od dawki. WNK4 445-563, który wykracza poza dziedzinę autohazy, nie miał żadnego efektu. Wyniki są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach. (F) KS-WNK1 2a 84 nie hamuje aktywności PKA aktywowanej cAMP, co wykryto przez fosforylację domeny transbłonowej transduktromagnetycznej mukowiscydozy (CFTR). KS-WNK1 i WNK4 hamują aktywność kinazy WNK3. Donoszono wcześniej, że KS-WNK1, izoforma z niedoborem kinazy zależnej od nerki WNK1, wywiera dominujący negatywny wpływ na WNK1 (23). KS-WNK1 hamuje również wpływ WNK1 na kanał nerkowy zewnętrznego szpiku kostnego (ROMK, Kir 1.1) (26, 27), co sugeruje, że jest to ogólne działanie KS-WNK1. Donoszono również, że autoinhibitorowa domena WNK4 hamuje aktywność kinazy WNK1 in vitro (21), dostarczając dowodów na to, że kinazy WNK tworzą kompleks regulacyjny. Tutaj badaliśmy, czy KS-WNK1 i WNK4 mogą hamować aktywność kinazy WNK3, podobnie jak w przypadku WNK1. Wyniki (Figura 2D) wykazały, że unikalna domena N-końca KS-WNK1 (KS-WNK1 2. 84) hamowała aktywność kinazy WNK3 w sposób zależny od dawki. My (21) i inni (25) wykazali wcześniej, że domena autoinhibitorowa WNK4 tłumi aktywność kinazy WNK1. Tutaj pokazujemy, że aktywność kinazy WNK3 można również stłumić przez domenę autoinhibitorową WNK4 (WNK4 445. 518) (Figura 2E). Dłuższy WNK4, który nie wykazuje aktywności autoagresywnej, nie hamował aktywności kinazy WNK3 (Figura 2E). Te efekty inhibitora są specyficzne dla WNK3, ponieważ KS-WNK1 2. 84 nie hamuje aktywności PKA zależnej od cAMP (Figura 2F). Wyniki dostarczają dalszych dowodów na to, że domeny funkcjonalne kinazy WNK regulują nie tylko siebie, ale także innych członków rodziny kinaz WNK jako kompleks sygnalizacyjny. WNK3 wiąże się z WNK4 w kompleksie białkowym. Zgłaszano, że WNK1 tworzy homotetramery (25). Wcześniej opisywaliśmy, że WNK1 i WNK4 tworzą kompleksy białkowe, gdy ulegają ekspresji w oocytach (22), co sugeruje, że mogą również występować kompleksy heteromeryczne. WNK1, WNK4 i WNK3 są wyrażane przez komórki DCT (20, 28). Tutaj testowaliśmy, czy WNK3 i WNK4 kojarzą się w kompleksie białkowym. Figura 3A pokazuje, że WNK4 wytrącony anty-myc i że anty-WNK4 może strącić myc-WNK3, gdy białka ulegają ekspresji w oocytach Xenopus lub w linii komórek ssaków (HEK293t)
[patrz też: lcs płońsk, glos slupcy, medikur kołobrzeg ]