pelplin przychodnia

Startery do reakcji do przodu i do tyłu były 5. -AGACTCCCGGAACGCCAGT-3. i 5. -gtgtccaagtgaagcctcgt-3 ., odpowiednio. Allel typu dzikiego wytwarzał 4 fragmenty (258, 230, 120 i 19 pz), podczas gdy allel G znajdujący się u pacjenta wytwarzał 3 fragmenty (378, 230 i 19 pz), gdy zmiana przerywa z 3 BsrI. witryny z ograniczeniami. Analiza obliczeniowa. Wyrównanie wielu sekwencji przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania GQG Accelrys (wersja 11.1.3). Strukturalną analizę mirozynazy przeprowadzono za pomocą oprogramowania O (wersja 11.0.4; http://xray.bmc.uu.se/~alwyn/). Wektory ekspresji. Związane z błoną i wydzielane formy ludzkich cDNA KL klonowanych do wektora ekspresji pcDNA3.1 / V5-His (Invitrogen) były hojnym darem od Harolda Dietza (Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland, USA). Zmutowane cDNA KL-H193R wytworzono przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce QuikChange (Stratagene). Ludzki FGFR1c zamplifikowano PCR z hFGFR-1 (ATCC) i wklonowano do wektora ekspresyjnego pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). Ludzki mutant FGF23 (R176Q) wklonowany do wektora ekspresyjnego pFLAG-CMV-3 (Sigma-Aldrich) opisano wcześniej (31). Wszystkie konstrukty sekwencjonowano w celu weryfikacji wprowadzenia prawidłowej mutacji i braku artefaktów klonowania. HEK293 hodowla komórkowa i transfekcja. Komórki HEK293 (ATCC) hodowano w pożywce DMEM / F-12 (Invitrogen) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (HyClone, Thermo Fisher Scientific), 1% L-glutaminą, 1% pirogronianem sodu i 1% penicyliną-streptomycyną w 37 ° C i 5% CO2. Subkonfluentne komórki przejściowo transfekowano plazmidowym DNA typu dzikiego typu KL lub H193R KL, stosując Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Po transfekcji komórki utrzymywano w hodowli przez dodatkowe 48. 96 godzin przed zbiorem komórek i zebranie kondycjonowanej pożywki. W celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych, komórki transfekowano plazmidowym DNA H193R i dzikiego typu, ponownie umieszczono na 20-cm płytkach i selekcjonowano na pożywce zawierającej 450 .g / ml genetycyny (Invitrogen) przez 2 tygodnie. Monokondy oporne na neomycynę wybrano do ekspansji. W eksperymentach dotyczących ratowania temperatury komórki stabilnych linii komórkowych KL podzielono równo na dwie 60-milimetrowe płytki i hodowano przez 48 godzin w 37 ° C lub 28,5 ° C. Immunoblot. Lizaty komórkowe i kondycjonowane pożywki poddawano elektroforezie na 10% gotowych żelach żelowych Tris-HCl Ready (Bio-Rad) i przenoszono na błony nitrocelulozowe. Membrany inkubowano z przeciwciałem V5 skoniugowanym z HRP (Invitrogen). Immunoblots zostały opracowane za pomocą ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare). Analiza ekspresji genu EGR1. Komórki HEK293 (2 x 105 komórek / dołek) przejściowo transfekowano 0,5 .g plazmidowego DNA zawierającego KL typu dzikiego lub zmutowanego związanego z błoną KL, stosując odczynnik FuGENE 6 (Roche Applied Science). Komórki transfekowane pustym wektorem DNA służyły jako kontrola negatywna. Transfekowane komórki głodzono pożywką wolną od surowicy plus 0,2% BSA przez 24 godziny, a następnie traktowano przez 30 minut zaróbką (PBS) lub 100 ng / ml FGF23 niosącymi mutacje R176Q i R179Q ADHR. Całkowity RNA ekstrahowano z komórek przy użyciu zestawu RNeasy Mini (Qiagen). Startery i sondy TaąMan specyficzne dla ludzkiego EGR1 i mRNA p-aktyny zaprojektowano przy użyciu oprogramowania Primer Express (wersja 2.0, Applied Biosystems). EGR1 i mRNA p-pektyny amplifikowano ze 100 ng całkowitego RNA przy użyciu zestawu TaąMan Gold RT-PCR (Applied Biosystems) w systemie ABI-PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Względną ekspresję genów określono przez analizę danych przy użyciu metody 2 . Ct (32). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą sparowanego testu Tukey-Kramer, który był rzeczywiście znaczący (HSD) przy użyciu JMP Statistical Discovery Software 4.1 (SAS Inc.). Immunoprecypitacja
[patrz też: animusz rzeszów, whibz, alkadis ]