poradnie warszawa

Najpierw przeprowadziliśmy testy ChIP przy użyciu starterów obejmujących miejsce wiązania Cs1 Hes1 w różnicujących się komórkach C2C12. Wykryliśmy endogenny Foxo1, Notch1 i CsI w immunoprecypitatach z niezróżnicowanych komórek (Figura 4D). Ponieważ sekwencja amplifikowana przez PCR nie zawiera żadnych miejsc wiążących widełki, doszliśmy do wniosku, że Foxo1 wiąże się z tym fragmentem DNA poprzez CsI. Co więcej, wiązanie obu Foxo1 i Notch1 zmniejszyło się, gdy komórki stały się zróżnicowane (dni i 2). Kiedy transdukowaliśmy komórki konstytucyjnie jądrowym Foxo1-ADA, różnicowanie zostało zahamowane (Figura 1C), a zmutowany Foxo1 był trwale związany z promotorem Hes1, podobnie jak Csl i Notch1 (Figura 4D). Następnie analizowaliśmy ekspresję Hes1. Przewidywano, że poziomy Hes1 powinny korelować z zajętością promotora Hes1 przez Foxo1 i Notch1. Rzeczywiście, ekspresja mRNA Hes1 zmniejszyła się, gdy wiązanie Foxo1 i Notch1 z CsI zmniejszyło się, podczas gdy poziom białka miozynowego wzrósł (Figura 4D). Aby wykluczyć bezpośredni wpływ Foxo1 na transkrypcję Cs1, przeprowadziliśmy testy genu reporterowego z promotorem Cs1. Foxo1 nie aktywował ekspresji genu reporterowego Csl pomimo obecności 10 powtórzeń miejsca wiążącego widełki w promotorze Cs1 (odnośnik 41 i dane nie pokazane). Ponadto, ekspresja CsI nie uległa zmianie w komórkach C2C12 wyrażających Foxo1-ADA (dane nie pokazane). Dane te wskazują, że Foxo1 reguluje zależne od Notch różnicowanie poprzez oddziaływania białko-białko z CsI. Foxo1 jest wymagany do indukowania Notch genów Hes i Hey przez Csl. Zbadaliśmy zdolność Foxo1-ADA do promowania ekspresji endogennych Hes1, Hes5 i Hey1 w komórkach C2C12. Zarówno Foxo1-ADA, jak i Notch1-IC zwiększają ekspresję 3 genów, podczas gdy siRNA Foxo1 hamuje ekspresję Hes1, Hes5 i Hey1 indukowaną przez Notch1-IC (Figura 5A). SiRNA Foxo1 nie wywierał wpływu na ekspresję Hes1, Hes5 i Hey1 w komórkach z niedoborem czynnika wzrostu (Figura 5A). Figura 5Foxo1 reguluje ekspresję Hes1, Hes5 i Hey1 indukowaną Notch. (A) Ekspresja Hes1, Hes5 i Hey1 zmierzona za pomocą półilościowego RT-PCR w komórkach C2C12 transdukowanych Foxo1-ADA lub Notch1-IC po transfekcji siRNA GFP, Foxo1 lub CsI jak wskazano. (B) Testy genu reporterowego Hes1 w komórkach HEK293 transdukowanych Foxo1-ADA, Notch1-IC, siatko Foxo1, siRNA GFP lub plazmid kontrolny (pusty). Mierzyliśmy aktywność lucyferazy i znormalizowaliśmy ją przez aktywność p-galaktozydazy. Dane reprezentują dowolne jednostki w stosunku do kontrolnego pustego wektora. Skupiliśmy się na następnej serii eksperymentów na Hes1, jako prototypowym genie docelowym Notch. Testowaliśmy zdolność Foxo1 do regulacji transkrypcji Hes1 przy użyciu testów reporterowych z promotorem Hes1, jak również pomiarów ekspresji Hes1. Foxo1-ADA i Notch1-IC indukowały aktywność promotora Hes1 odpowiednio o 1,8- i 2,5-krotnie. Kotransfekcja Foxo1-ADA z Notch1-IC powodowała 2,5-krotny wzrost (Figura 5B). Kotransfekcja siRNA Foxo1 hamował indukowaną Notch aktywność Hes1 w sposób zależny od dawki, podczas gdy siRNA kontrolna nie miała działania (Figura 5B). Uzyskaliśmy podobne wyniki z syntetycznym reporterem Hes1 zawierającym 4 powtórzenia tandemowe motywu wiążącego CsI (Supplemental Figure 7). Co więcej, DBD-Foxo1-ADA był zdolny do indukowania aktywności genu reporterowego Hes1 w jeszcze większym stopniu niż Foxo1-ADA, potwierdzając, że bezpośrednie wiązanie DNA nie jest wymagane do aktywacji Fox11 Hes1 (Figura 2C). Niepowodzenie Notch1-IC indukowania ekspresji Hes1 w komórkach eksprymujących siRNA Foxo1 sugeruje, że Foxo1 jest wymagany do interakcji Cs1 / Notch. W związku z tym zbadaliśmy wiązanie Foxo1 i Notch1 do promotora Hes1 w systemie współhodowli. Miekliśmy komórki C2C12 eksprymujące Notch1 z komórkami HEK293 wyrażającymi ligand Notch Jagged1 w celu indukcji aktywacji endogennego sygnalizowania Notch
[przypisy: whibz, layman elbląg, animusz rzeszów ]