sakowski kardiolog namysłów

Cztery dni po iniekcji oocyty utrwalano 3% paraformaldehydem w PBS przez 4 godziny w temperaturze 4 ° C. Sześć mikrometrowych krioprobówek umieszczono na szklanych szkiełkach powleczonych żelem-ałunem, blokowanych buforem PBS zawierającym 0,1% BSA i inkubowano z anty-mysim NCC, rozcieńczonym w buforze PBS zawierającym 0,1% BSA i 0,05% Tween-20 ( 1: 100) w 4 ° C przez noc. Skrawki przepłukano czterokrotnie PBS, inkubowano z kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG H + L sprzężonym z FITC (1: 200; Zymed Laboratories Inc.) przez godzinę w 22 ° C i przepłukano czterokrotnie buforem PBS. Następnie slajdy oglądano na mikroskopie z kontrastem fazowym Zeiss Axiophot. 22 Przyjęcie. Eksperymenty wychwytu 22Na przeprowadzono jak opisano wcześniej (15), z pewnymi modyfikacjami. Trzy dni po wstrzyknięciu cRNA oocyty inkubowano w pożywce bez chlorków przez 3. 4 godziny w 18 ° C, zanim zmierzono wychwyt Na. Szablon DNA (NCC, WNK1, KS-WNK1, WNK3 i WNK4) został linearyzowany w dół od 3. region nieulegający translacji, przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych i transkrybowany przy użyciu polimerazy RNA T7 (mMESSAGE mMACHINE; Ambion). Do posortowanych oocytów Xenopus wstrzykiwano po 50 nl wody, po 3 . 5 ng NCC, WNK3, WNK4 lub różnych skróconych konstruktów. O ile nie zaznaczono inaczej, ilość wstrzykniętego cRNA NCC wynosiła 3 ng, a wstrzyknięty cRNA WNK3 wynosił 0,5. ng. Dla każdego warunku doświadczalnego wstrzyknięto 10. 20 oocytów. n, podane w postaci legend, przedstawia liczbę niezależnych eksperymentów. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i użytkowania zwierząt Oregon Health & Science University. Immunoblot. Immunobloty oocytów przeprowadzono w sposób opisany uprzednio przez naszą grupę (22, 23) Immunoprecypitacja. Oocyty wytworzono jak opisano powyżej dla Western blotting. Pierwotne przeciwciało (2. L) dodano do homogenatu oocytów (10 oocytów w 600. L) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę (lub w 4 ° C przez noc). Dodano trzydzieści mikrolitrów A. sepharose białka (Amersham Biosciences) i inkubowano w 4 ° C przez noc. Mieszaninę reakcyjną odwirowano, a perełki przemyto 5-krotnie buforem do homogenizacji. Immunoprecypitowane białko eluowano z białka A-sefarozy przez ogrzewanie mieszaniny do 100 ° C przez 10 minut z buforem do próbek zawierającym 2,5% SDS i 2,5% (3-merkaptoetanolu. Immunoprecypitaty analizowano za pomocą SDS-PAGE i poddawano blottingowi, jak opisano powyżej. Przejściowe transfekcje i immunoprecypitacja. Komórki HEK293T (ATCC) hodowano w 37 ° C z 5% CO2 w MEM Vitacell uzupełnionym 2 mM streptomycyną / penicyliną i 10% FCS. Przejściowe transfekcje przeprowadzono za pomocą SuperFect Transfection Reagent (QIAGEN) zgodnie z instrukcjami producenta. Po transfekcji komórki inkubowano przez 48. 72 godzin. Komórki traktowano 100 mM NaCl przez 10 minut przed zbiorem. Komórki następnie przemyto zimnym PBS i lizowano w 4 ° C w buforze (10 mM Tris HCl, pH 8,0, 2,5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 8,0, 0,5% Triton X-100, mM Na3VO4, 50 mM NaF, i 100 .l zestawu koktajlowego inhibitora proteazy III [Calbiochem] na 10 ml buforu). Lizaty oczyszczono przez odwirowanie, a supernatant zastosowano do immunoprecypitacji. Stężenia białek oznaczono metodą Bradforda (Bio-Rad). Dla każdej immunoprecypitacji ekstrakty inkubowano z 0,5 .g mysiego monoklonalnego anty-HA lub anty-Myc (12CA5, Roche Diagnostics Corp. lub Sigma-Aldrich) lub 0,5 .g oczyszczonego króliczego poliklonalnego anty-WNK1 / WNK4 przez 2 godziny. lub przez noc w 4 ° C. Immunokompleks wytrącono przez inkubację z 40 .l zawiesiny 50% białka A-sepharose (Amersham Biosciences) przez godzinę w temperaturze 4 ° C. Immunoprecypitaty przemyto 3 razy PBS Związane białko eluowano przez gotowanie przez 10 minut w buforze do próbek 2X SDS. Immunoprecypitaty analizowano za pomocą SDS-PAGE i poddawano blottingowi, jak opisano powyżej. Statystyka. Porównywano grupy za pomocą niesparowanego dwustronnego testu ucznia. W przypadku wielokrotnych porównań zastosowano korektę Bonferroniego. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Podziękowania Autorzy dziękują Arohanowi Subramanya i Jamesowi McCormickowi za pomocne dyskusje i dostarczanie konstruktów. Autorzy uznają także Sarę Humphreys za pomoc techniczną i Petera Jordana za przeciwciało anty-WNK3. Praca ta została wsparta dotacją z NIH (DK51496). Przypisy Niestandardowe stosowane skróty: DCT, dystalne kanalik kanalikowy; FHHt, rodzinne nadciśnienie hiperkalemiczne; GST, transferaza S glutationu; NCC, kotransporter wrażliwy na tiazyd Na-Cl; WNK, bez lizyny (K). Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.117: 3403. 3411 (2007). doi: 10.1172 / JCI32033 Zobacz powiązane artykuły w sieci kinaz nerkowych regulujących kormransport jonów nerek i hormon przytarczyczny hamuje transport fosforanu nerkowego przez fosforylację seryny 77 czynnika regulacyjnego wymiennik sodowo-wodorowy 1.
[podobne: uzależnienia behawioralne, pistolety na kulki allegro, melita medical wrocław ]