srodek na ukaszenia komarow

Konieczne będą dalsze badania, aby przetestować ten model w bardziej fizjologicznych systemach modelowych. WNK4 postulowano również, aby działał jako przełącznik molekularny (41, 42), ponieważ może hamować aktywność NCC w swoim stanie naturalnym, ale traci tę zdolność w chorobie ludzkiej. Postulowano, że niezidentyfikowany ligand naśladuje aktywność przełączania, która występuje, gdy wprowadzane są mutacje FHHt (41, 42). Podobna hipoteza została zaproponowana w celu wyjaśnienia fizjologicznej roli WNK3. W tym przypadku zmiana aktywności funkcjonalnej występuje, gdy kinaza-aktywna WNK3 jest zmutowana, aby uczynić go nieaktywną kinazą. To również sugeruje naśladowanie skutków zaburzeń fizjologicznych, być może osiągniętych przez oddziaływanie z niezidentyfikowanymi ligandami (20). Zgodnie z opisanym tutaj modelem kompleksu kinazy WNK, WNK3 może wiązać się i hamować działanie WNK4, a WNK4 może wiązać się i hamować działanie WNK3. Zatem WNK4 może być fizjologicznie istotnym ligandem dla WNK3, który przełącza swój efekt netto ze stymulacji na hamowanie; odwrotnie, WNK3 może być fizjologicznie istotnym ligandem dla WNK4, który zmienia swój efekt netto z hamowania na stymulację. Model ten wymaga dalszych bezpośrednich testów, ale zapewnia prawdopodobny związek między procesami fizjologicznymi a zdarzeniami związanymi z chorobą. Metody konstrukty DNA. Mysz WNK4, szczur WNK1 i ludzki WNK3 zostały wcześniej wygenerowane (15, 21. 23). Inne konstrukty wytworzono przez PCR, takie jak GST-claudin i domena R GST-CFTR lub przez ukierunkowaną mutagenezę, stosując zestaw QuickChange (Stratagene). Wszystkie sekwencje potwierdzono przez sekwencjonowanie (Vollum Institute, Oregon Health & Science University). Ekspresja i oczyszczanie białek fuzyjnych GST. Nocną hodowlę bakteryjną szczepu BL21 E. coli (DE3) transformowanego odpowiednim plazmidem rozcieńczono i hodowano w 37 ° C przez 3 godziny. Ekspresję białka indukowano przez dodanie izopropylo-l-tio-galaktopiranozydu do końcowego stężenia 0,1. 0,4. M. Hodowla rosła w temperaturze 28 ° C przez kolejne 3. 6 godzin, a komórki zebrano przez odwirowanie. Protokół oczyszczania zmodyfikowano zgodnie z instrukcjami producenta dla perełek glutationu-Sepharose-4B i był on przez nas szeroko stosowany (22). Frakcje zebrano i zatężono w kolumnie o wartości odcięcia masy cząsteczkowej 30 kDa i przechowywano w porcjach zawierających 10% glicerolu w temperaturze. 20 ° C aż do użycia. Test rozwijania GST. Piętnaście nanogramów GST lub ekspresjonowanych konstruktów N- i C-końcowych GST-WNK4 unieruchomiono na 20 ul perełek glutationowo-agarozowych w 0,5 ml PBS zawierającego 0,1 mg / ml BSA. Po trzykrotnym przemyciu PBS, 50 mg lizatu komórkowego HEK293 inkubowano z kulkami przez godzinę w temperaturze 4 ° C. Kulki peletowano i przemyto 3 razy 50 mM Tris (pH 7,4), 0,3 M NaCl i 0,1% Triton X-100. Wytrącone białka rozdzielano przez SDS-PAGE i Western blotowano przy użyciu króliczego anty-ludzkiego WNK3 (miły dar od Petera Jordana, Centro de Genética Humana, Instituto Nacional de Saúde, Dr. Ricardo Jorge, Lizbona, Portugalia, nr ref. 32). Testy fosforylacji in vitro. Reakcje kinazy prowadzono w 30 ul 10 mM HEPES (pH 8,0), 10 mM MgCl2, mM benzamidyny, mM ditiotreitolu i 50 ul zimnego ATP, z 0,22 mCi / ml [32P] ATP zawierającego aktywną kinazę i substrat w 30 ° C przez 30 minut. Reakcje zatrzymano przez dodanie buforu do próbek SDS, a następnie wrzenie przez 2 minuty. Reakcje (30 ul) rozdzielono metodą SDS-PAGE na żelu gradientowym 4%> 12% Bis-Tris. Produkty fosforylowane wizualizowano za pomocą autoradiografii. Oznaczenie kinazy PKA zależnej od cAMP przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta (New England Biolabs Inc.). Kwantyfikacja wyników była taka, jak opisano poprzednio (23). Znakowanie immunofluorescencyjne NCC wyrażone na powierzchni oocytu
[hasła pokrewne: po której stronie jest serce, melita medical wrocław, medikur kołobrzeg ]