warszawa szpital dziecięcy litewska

Włókna mięśniowe były typowane przy użyciu metachromatycznej ATPazy (50) lub immunobarwienia z mysinową wolno-szkieletową wolno (Sigma-Aldrich). W badaniach zarodkowych ustanowiliśmy czasowe kojarzenie heterozygotycznych myszy Foxo1 (24) lub Notch1 (25) i odzyskano zarodki w E9.5. mRNA wyizolowano z całych zarodków i przeprowadzono RT-PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano poniżej. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Columbia. Wirusowe badania ekspresji. Komórki C2C12 różnicowano zgodnie z opisem (3, 4). Opisano wektory ekspresyjne Foxo1-ADA, Notch1-IC, Jagged1, Csl i Notch wabiki adenowirusowe i ssacze (36, 51). Wygenerowaliśmy retrowirusy eksprymujące Foxo1-ADA i Notch1-IC przy użyciu wektora pQCXIH (Clontech). W celu wytworzenia wabika Notch (pAdlox Notch1ECD-Fc) zewnątrzkomórkową domenę Notch1 (bp 241-4229, numer dostępu GenBank X57405) połączono w ramce z ludzkim znacznikiem Fc IgG i sklonowano w pAdlox. Supernatant retrowirusowy wytworzono z komórek przejściowo kotransfekowanych wektorem pVSV-G (Clontech) i oznaczono wektor pQCXIH w komórkach GP2-293 (BD Biosciences). W celu wytworzenia Foxo1 z niedoborem wiązania DNA, zastąpiliśmy N208 i H212 odpowiednio alaniną i argininą, stosując zestaw do mutagenezy QuikChange (Stratagene). Mutacje następnie klonowano w szkielecie mutanta Foxo1-ADA. Test lucyferazy i test ko-kultury. Transfekowaliśmy komórki HEK293 heli-lucyferazą Hes1 (<194 do 160 z miejsca startu transkrypcji) (Hes1 / pGL2 basic [Stratagene]), syntetyczną Hes-lucyferazę (zawierającą miejsce wiązania 4 x CsI, 4 x Csl / pGL2 zasadowe) lub CsI -liferazy (. 1536 do 22, Csl / pGL2 podstawowe) geny reporterowe wraz z pCMV5, pCMV5-Foxo1-ADA, pQNC. Notch1-IC, pHyTc (51), pułapka Notch lub siRNA Foxo1. Zastosowaliśmy plazmid pRSV. - galaktozydazę jako kontrolę skuteczności transfekcji (51). W teście kokultowym eksprymowaliśmy Notch1 w komórkach C2C12 i Jagged1 lub LacZ w komórkach HEK293 przez transfekcję. Następnie zebrano komórki HEK293 i wysiano je na komórki C2C12. Po godzinie inkubacji wykorzystaliśmy wspólnie hodowane komórki do eksperymentów. Western blotting i immunoprecypitacja. Przeprowadziliśmy te testy zgodnie ze standardowymi technikami stosującymi anty-miozynę (MF-20), anty-HA (12CA5, Boehringer Mannheim), anty-FLAG (M2, Sigma-Aldrich), anty-Foxo1 (H128 i N20; Santa Cruz Biotechnology Inc.), anty-Notch1 (C-20, Santa Cruz Biotechnology Inc.), anty-Csl (Millipore i Santa Cruz Biotechnology Inc.), anty-NcoR (Santa Cruz Biotechnology Inc.), anty-Smrt (Santa Cruz Biotechnology Inc.) lub przeciwciał anty-MAML1 (Millipore). Do koimmunoprecypitacji Foxo / Csl zastosowano oczyszczone frakcje jądrowe (52). Ponieważ Csl migruje blisko łańcucha ciężkiego IgG na SDS-PAGE, użyliśmy dimetylopirymilidanu (DMP, Pierce) do połączenia krzyżowego z przeciwciałami z kulkami białka A i uniknięcia zanieczyszczenia IgG wyeluowanych kompleksów białkowych (52). Testy ChIP. Przeprowadziliśmy testy ChIP w komórkach C2C12, jak opisano wcześniej (4) i w hodowanych komórkach, jak opisano w Fryer (42). Pary starterów zastosowane do amplifikacji miejsca wiązania Cs1 promotora Hes1 są następujące: 5a-GCAAAGCCCAGAGGAAAGAGTTAG-3. i 5 -AGAGAGAGAGGTAGACAGGGGATTC-3 .. transfekcja siRNA i Foxo1 oporny na siRNA. Sekrema specyficzna dla Foxo1 siRNA to 5a-ACGGAGGATTGAACCAGTATA-3 .. Sekwencja siRNA specyficzna dla CsI to 5a-TAGGGAAGCTATGCGAAATTA-3 .. siRNA transfekowano przy użyciu odczynnika lipofectamine-plus (Invitrogen). Wytworzyliśmy oporny na siRNA Foxo1 przez zastąpienie 3 reszt (podkreślone) w sekwencji 5a-ACGGCGGTCTGAACCAGTATA-3 .. Sekwencje primerów zastosowane w badaniach RT-PCR w czasie rzeczywistym są w metodach dodatkowych. Rekombinowane białka i testy interakcji [więcej w: medikur kołobrzeg, cosinus torun, przychodnia mościckiego tarnów ]